Autofluoreszenz-Systeme und ihre Anwendungsfelder

Deutlich mehr „sehen“

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21.02.2011 Das Monitoring luftgetragener, keimbildender Organismen gehört zum klassischen Repertoire der pharmazeutischen Mikrobiologie. Als Diagnosewerkzeuge halten gegenwärtig Schnellmethoden Einzug in das aseptische Produktionsumfeld. Der Beitragbeschreibt eine Methode zur Luftkeimzählung in Echtzeit mitsamt ihrer Grundlagen, dem apparativen Aufbau, Anwendungsfelder sowie Abgrenzungen zur konventionellen Methodik.

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Entscheider-Facts Für Anwender

  • Mithilfe von Autofluoreszenz-Keimzählern können pharmazeutische Produktionsprozesse lückenlos begleitet, auf Einzelereignisse und sogar Niveauverschiebungen begutachtet werden.
  • Unverhältnismäßige Aktionen nach der Auszählung einzelner CFUs können damit in Zukunft vermieden werden oder deutlich abgeschwächt ausfallen.
  • Anwenderberichte zeigen ebenfalls, dass Autofluoreszenz-Keimzähler eine wichtige Rolle bei der Erstqualifizierung von Produktionsanlagen übernehmen.
  • Anwendungen im Bereich des kontinuierlichen GMP-Monitoring und der Produktfreigabe (Stichwort: Parametric Release) sind in der Vorbereitung.
Deutlich mehr „sehen“

Autofluoreszenz-Luftkeimzähler (Bilder: PMT)

Treibende Kraft hinter dem mikrobiologischen Monitoring in der Pharmaindustrie sind die einschlägigen Standards. Den Produktionsalltag dominieren der FDA „Guidance for Industry, Sterile Drug Products“ und der korrespondierende EU „Guide to Good Manufacturing Practice“. Diese Dokumente beachten nur diejenigen Luftkeime, die noch zu einem Stoffwechsel fähig sind. Denn vorhandene Keime sind auf geeigneten Nährmedien zu sammeln und durch Bebrüten zu vermehren. Nach Abschluss der Vermehrungsphase werden die Bakterienkolonien ausgezählt und als sogenannte Colony Forming Units (CFU) ausgewiesen. Die EU/FDA-Anforderungen an aseptische Produktionsbereiche sind streng. Für Grade A-Bereiche (EU) bzw. Critical Areas (FDA) werden weniger als eine CFU/m3 Reinraumluft spezifiziert. Bei so engen Akzeptanzkriterien leuchtet es ein, dass eine mikrobiologische Bewertung schnellstmöglich vorliegen sollte. Leider liefert der konventionelle Weg zur CFU-Bestimmung erst nach Tagen verlässliche Zählergebnisse. Auch bildet die Probenahme per Sedimentationsplatten oder aktivem Luftkeimsammler nur einen kurzen Zeitabschnitt der Fertigung ab.

Geschädigte oder inaktive Keime sind ebenso wenig erkennbar wie mikrobiologische Systeme, die sich vom verwendeten Nährmedium nicht zur Vermehrung angeregt fühlen. Völlig illusorisch ist auch der Nachweis von Keimen, die vom physikalischen Prozess des Sammelns – zum Beispiel Impaktion – geschädigt werden. Insgesamt also Gründe genug für Mikrobiologen, sich Methoden zu wünschen, die eine mikrobiologische Luftbelastung vollständig und ohne Zeitverzug nachweisen. Mit der Verfügbarkeit neuer Laserlichtquellen erhalten die konventionellen Methoden nunmehr genau diese Ergänzung.

Die Vorstufe: Durchflusszytometrie

Zahlreiche biologische Systeme lassen sich gut mit kurzwelligem Licht energetisch anregen und reagieren mit Re-Emission von niederfrequenterem Licht. Dieser Fluoreszenz-Effekt wurde auch bereits in der jüngeren Vergangenheit für mikrobiologische Analysen eingesetzt. In sogenannten Durchflusszytometern werden Fluoreszenzfarbstoffe durch Stoffwechselprozesse an Mikroorganismen gekoppelt. Dieser Vorgang erfolgt grundsätzlich in wässriger Lösung. Die Kombination Organismus/Farbstoff gelangt in die Wechselwirkungszone eines oder mehrerer Laser. Während passive, nicht stoffwechselnde Partikel lediglich Streulichtimpulse elastisch emittieren (emittierte Lichtwellenlänge entspricht eingekoppelter Lichtwellenlänge), verraten sich stoffwechselnde Organismen durch ein zusätzliches Fluoreszenzsignal. Damit repräsentiert die Durchflusszytometrie ein durchaus brauchbares Analyseverfahren zur Keimzahlbestimmung. Prinzipbedingt werden flüssige Proben nur mit einer vorhergehenden Probenaufbereitung analysiert. Auch dauert die Anbindung des Fluoreszenzfarbstoffes eine gewisse Zeit. Daher liegt eine typische Labormethode im diskontinuierlichen Betrieb vor. Um auch Reinraumluft – in Echtzeit – analysieren zu können, ist eine Erweiterung des Prinzips zum Verzicht auf Farbstoffe nötig.

Erkennen und Größenklassifizierung biologischer Systeme

Die Methode basiert auf der Idee, charakteristische Moleküle eines Mikroorganismus zur selbstständigen Fluoreszenz anzuregen. Spektroskopische Detailanalysen ergeben, welche Schlüsselmoleküle mit möglichst einer einzigen Wellenlänge anzuregen sind. Beim vorgestellten Analyseverfahren werden NADH – ein Koenzym, das an zellulären Stoffwechselreaktionen beteiligt ist – und Riboflavin – Vitamin B2, wichtig für Stoffwechselprozesse – als repräsentative Molekülarten in vegetativen Bakterien angeregt. Dekosa Panthotensäure (DPA, eine Fettsäure) emittiert ebenfalls Fluoreszenz und ist in Bakteriensporen zu finden. Die Fluoreszenz-Emissionskurven aller drei Moleküle überlappen sich interessanterweise in nahen UV und im violetten Spektralbereich. Daher liegt es nahe, zur Anregung der Fluoreszenz hochwertige Diodenlaser mit 405 nm Wellenlänge (violettes Licht) einzusetzen.

Beim apparativen Aufbau sind grundsätzlich Anleihen aus der Konstruktion von konventionellen Laser-Streulicht-Partikelzählern (OPC gemäß ISO 21501–4) erkennbar. Die Gasprobe wird durch das Messgerät gesaugt und mittels Düsensystemen zur optimierten Wechselwirkungsgeometrie geformt. Hauptunterschied zum konventionellen OPC ist die Verwendung eines recht kurzwelligen 405-nm-Lasers und die Integration eines zweiten Nachweiskanals. Ein Sekundär-Elektronen-Vervielfacher (Photo Multiplier) erfasst schwache Autofluoreszenz-Signale der biologischen Luftbestandteile. Simultane Detektion elastischer und inelastischer Streuvorgänge erlaubt ein Erkennen und die Größenklassifizierung biologischer Systeme. Das Auflösungsvermögen der Optik stellt sicher, dass Sporen und Bakterien dargestellt werden können.
Als Hilfsinformation liefert die Erfassung von 405-nm-Streulicht in Vorwärtsstreuung konventionelle Partikeldaten, deren Größenkanäle mit ISO5-Reinräumen konform sind. Speziell der 5,0-µm-Partikelkanal kann die Interpretation von biologischen Zählergebnissen sinnvoll unterstützen. Der apparative Gesamtaufbau eines solchen Systems unterscheidet sich nicht wesentlich von dem eines konventionellen Partikelzählers. Alle Erkenntnisse zur bestmöglichen Probenahme – isokinetische Probenahmesonde; Bevaline-Verschlauchung, Minimierung der Schlauchlängen, etc. – können für die neue Messmethode übernommen werden.

Empfindlichkeit und Vergleich mit konventionellen Methoden

Zunächst einmal detektiert ein Autofluoreszenz-Luftkeimzähler konventionelle Luftkeime mit aktivem Stoffwechsel (klassische CFUs) und Luftkeime im Sporenstadium (potenzielle CFUs). Darüber hinaus werden aber auch geschädigte und sogar abgetötete Luftkeime nachgewiesen, die konventionelle Nährmedien-Methoden unter keinen Umständen als CFUs erfassen. Jedem Mikrobiologen ist daher klar, dass die Zählergebnisse eines Autofluoreszenz-Gerätes über denen einer konventionellen Nährmedienmethode liegen müssen. Auch führt der Umstand einer zeitlich lückenlosen Beobachtung mit Auflösungen im Sekundenbereich zu signifikant verbesserten Zählstatistiken. Autofluoreszenz Luftkeimzähler „sehen“ deutlich mehr Ereignisse als Verfahren, die auf Vermehrung mit anschließender CFU-Zählung basieren. Ferner haben sie eine unvergleichbar bessere zeitliche Auflösung mit verbesserter Zählstatistik.

Es verbleibt die Frage, wie Schnellmethoden in den betrieblichen Alltag zu integrieren sind. Fest steht zunächst, dass die Zählergebnisse der neuen Methode, denen aus konventioneller CFU-Zählung massiv überlegen sind. Daher ist ein 1:1-Methodentausch nicht machbar und auch nicht unmittelbar sinnvoll. Die klassischen Methoden sind fest in den pharmazeutischen Regelwerken verankert und sollten zunächst die Kommunikationsbasis mit den Überwachungsbehörden bleiben. Das Autofluoreszenzgerät wird nun der klassischen Methodik als mächtiges Diagnose- und Qualifizierungswerkzeug zu Seite gestellt.

Bei auftretenden Problemen in der konventionellen Mikrobiologie wird die Schnellmethode zu Rate gezogen. Größere Messvolumina mit hoher statistischer Signifikanz lassen nicht nur Einzelprobleme sichtbar werden, sondern erlauben sogar ein stabiles Trending in Reinraumbereichen mit wenig Zählereignissen. Die Schnellmethode unterstützt den Mikrobiologen dabei, Problemen auf die Spur zu kommen oder sogar frühzeitig zu erkennen, das s sich die mikrobiologische Integrität einer aseptischen Produktion ungünstig zu entwickeln beginnt.

 

Heftausgabe: Februar 2011
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Jörg Dressler,  Geschäftsführer PMT Partikel Messtechnik

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Jörg Dressler, Geschäftsführer PMT Partikel Messtechnik
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