Mindestanforderungen an die Analytik im Rahmen einer Reinigungsvalidierung

Als dem Arzneimittelgesetz nachgeordnetes Regelwerk transformiert die Arzneimittel- und Wirkstoffherstellungsverordnung (AMWHV) die EU-GMP Richtlinien verbindlich ins deutsche Recht. Teil I der EU-GMP beinhaltet dabei die Grundsätze für die Herstellung von Arzneimitteln (vollständig konfektionierte Arzneimittel) und Teil II (ehemals ICH Q7a Dokument als Anhang 18 zum EU-GMP Leitfaden) umfasst die Richtlinien für Wirkstoffe (API), die als Ausgangsstoffe eingesetzt werden, nunmehr für Human- und Tierarzneimittel.

Alles plausibel dokumentieren

Der auf den PIC/S-Empfehlungen basierende Anhang 15 der EU-GMP Richtlinien thematisiert Qualifizierung und Validierung für die Bereiche des Herstellungs- und Reinigungsprozesses. Im Kontext der Reinigungsvalidierung ist die Verwendung validierter Analysenmethoden gefordert. Unter Punkt 37 des Abschnitts zur „Cleaning Validation“ des Annex 15 heißt es, dass „eine validierte Analysenmethode ausreichender Sensitivität für Kontaminant oder Rückstände mit einer für diese Zwecke ausreichend niedrigen Nachweisgrenze eingesetzt werden soll“. Validierte Analysenmethoden werden für Wirkstoffe beispielsweise in der European Pharmacopoeia (Ph. Eur.) vorgehalten. Auch im Falle von EN-, ISO- und DIN-Methoden, die zur Überprüfung von Akzeptanzkriterien im Rahmen einer Risikoanalyse eingesetzt werden, um etwa Rückstände von Reinigungs- und Desinfektionsmitteln zu bestimmen, handelt es sich in der Regel um validierte Methoden. Soll eine solche Methode im Labor eingesetzt werden, muss plausibel dokumentiert werden auf welchem Qualitätsniveau die Methode beherrscht wird und ob sich die dabei ermittelte Ergebnisunsicherheit in der für diese Methode akzeptierten und nach dem Stand der Technik ermittelten Grenzen bewegt. Die Daten hierzu können zum Beispiel aus Ringversuchen, wie etwa die Wiederhol- oder die Vergleichsgrenze, stammen.

Stellt sich nunmehr für das Labor die berechtigte Frage nach dem „Was muß mindestens gemacht werden ?“. Die Antwort ist so dehnbar, wie sie gleichzeitig unbefriedigend sein kann. Laut ISO 17025 „…muss die Validierung in dem Umfang durchgeführt werden, der zur Erfüllung der Erfordernisse der beabsichtigten Anwendung…notwendig ist.“ Das bedeutet in letzter Konsequenz, dass vom Validierungsverantwortlichen Art und Umfang bestimmt werden. Durch fachkompetentes Qualitäts-Risikomanagement kann dieser Freiraum dazu benutzt werden, den Validierungsaufwand auf ein – auch wirtschaftlich – erträgliches Maß zu reduzieren.

Entsprechend empfindlicheDetektionsmethode auswählen

Dass die Frage nach dem Mindestumfang nicht stereotyp beantwortet werden kann, zeigt folgendes Gedankenspiel: Angenommen, das Ergebnis der Risikobetrachtung bei der Produktion eines Arzneimittels X hat ergeben, dass nach erfolgter Reinigung der im Final Rinse maximal zulässige Wirkstoffgehalt Y nicht größer als Z µg/l betragen soll. Für den Analytiker heißt das, dass er nicht nur eine entsprechend empfindliche Detektionsmethode auswählen muss, sofern er denn die Wahl hat, sondern auch noch nebst aller Probenvorbereitungsschritte – Probennahme und Konservierung, Matrixaufreinigung, Isolierung des Analyten – angeben muss, mit welcher Sicherheit und unter welchen Bedingungen er die Ergebnisse reproduzieren kann. Und wenn die Ergebnisse reproduzierbar sind, muss er noch sicherstellen, dass er auch „den richtigen Wert“ bei vorgewählter Präzision angibt. Liegt der zu überwachende Wert Z im Bereich des apparativ Möglichen, kann bei Verwendung entsprechender Referenzlösungen unter Umständen auf eine Probenaufkonzentrierung verzichtet werden. Im umgekehrten Fall wird zu den übrigen Verfahrenskenngrößen auch der Schritt einer Probenaufkonzentrierung, beispielsweise durch Bestimmen der Wiederfindungsrate, berücksichtigt werden müssen. Liegt Z in der Nähe der „apparativen Nachweisgrenze“, muss er unter Umständen berücksichtigen, dass im Pharmabereich an der Bestimmungsgrenze eine relative Ungenauigkeit von 10% akzeptiert ist, hingegen bei „anderen Bestimmungen“ auch 33% als ausreichend erachtet werden.

Im Prinzip werden Antworten hierzu im allgemeinen durch das Ermitteln spezifischer Verfahrenskenngrößen der eingesetzten Methode unter Anwendung allgemein anerkannter mathematischer Algorithmen geliefert. Nach derzeitigem Kenntnisstand sollten bei der Dokumentation der Verfahrenscharakteristika – neben den deskriptiven Elementen einer Methode – mindestens folgende Merkmale

Arbeits- bzw. Messbereich (Messdaten der Grundkalibrierung),
Dokumentation und Test auf Ausreißerfreiheit für das unterste und oberste Konzentrationsniveau,
graphische Darstellung der Regressionskurven,
Regressionsparameter für den linearen und polynomischen (2.Grades) Kurventyp,
Linearität,
Prüfung auf systematische Fehler (Varianzenhomogenitätstest),
Verfahrensvariationskoeffizient,
Nachweisgrenze,
Erfassungsgrenze,
Bestimmungsgrenze und Vertrauensbereich (mindestens für die Bestimmungsgrenze)

berücksichtigt werden (ohne Anspruch auf Vollständigkeit).

Grundkalibrierung aufwendiger alsArbeitskalibrierung

Die Messdaten einer sogenannten Grundkalibrierung zur Ermittlung der Verfahrenskenndaten sollen den interessierenden Arbeitsbereich abdecken. Insbesondere soll die zu bestimmende Konzentration der Probe durch den kalibrierten Bereich abgedeckt werden. Es kann nicht empfohlen werden, die Verfahrenskenngrößen für den Bereich von 1 bis 10 ppm zu ermitteln, wenn die realen Proben im Konzentrationsbereich oberhalb des höchsten Standards liegen. Ein Verdünnen der Probe wäre zwar sinnvoll, dieser Schritt vergrößert aber auch gemäß dem Fehlerfortpflanzungsgesetz den Analysenfehler. Die Grundkalibrierung sollte nicht mit der arbeitstäglichen Kalibrierung verwechselt werden. Der Aufwand für eine Grundkalibrierung liegt dabei auch deutlich über der einer Arbeitskalibrierung.

Für das Ermitteln der Varianzen müssen oberer und unterer Arbeitspunkt der Kalibrierprobe mehrfach bestimmt werden. Mindestens sechs Bestimmungen sollten jeweils für die beiden Arbeitspunkte durchgeführt werden. Hierbei muss beachtet werden, dass die Proben voneinander unabhängig sind; anderenfalls überprüft man nämlich lediglich die Präzision des Analysengerätes. Die soll an dieser Stelle aber nicht geprüft werden. Die graphische Darstellung der Regressionskurven gibt visuell den funktionalen Zusammenhang zwischen der abhängigen Variablen (Informationswert) und der unabhängigen Variablen (Konzentrationswert) wieder.
Der einfachste Fall wird durch die Ursprungsgerade wiedergegeben. Unter bestimmten Bedingungen – insbesondere dann, wenn der Arbeitsbereich größer als der eigentliche lineare Bereich ist – kann beispielsweise die polynomische Funktion 2. Grades eine bessere Anpassung an die Messwerte liefern als die Geradenfunktion. Ist auf jeden Fall Linearität über den Arbeitsbereich gefordert, werden über einen F-Test die jeweiligen Reststandardabweichungen – das Maß für die Präzision eines Verfahrens – von linearer und polynomischer Funktion auf Signifikanz geprüft. Durch den Varianzenhomogenitätstest wird überprüft, ob die Abweichungen der Messwerte für den obersten und untersten Kalibrierpunkt im Arbeitsbereich eine Konzentrationsabhängigkeit zeigen, d.h. der Unterschied zufällig oder signifikant ist. Wird aufgrund der Prüfwerte auf Signifikanz positiv getestet, liegt oftmals ein systematischer Fehler vor. Der Arbeitsbereich ist dann anzupassen und die Methodenschritte zu überprüfen.

Nachweisgrenze istEntscheidungsgrenze

Mit der Angabe des Verfahrensvariationskoeffizienten wird die Leistungsfähigkeit eines Verfahrens wiedergegeben, dies ist besonders beim Methodenvergleich von Bedeutung. Die Nachweisgrenze ist eine Entscheidungsgrenze für das Vorhandensein einer Substanz bzw. eines Analyten. Sie ist also ein qualitatives Kriterium. Die Nachweisgrenze ist unter Verwendung einer ermittelten Kalibrierfunktion die Konzentration, die einem kritischen Wert der Informationen zugeordnet werden kann. Sie ist vom vorgewähltem Signifikanzniveau – Quantile der t-Verteilung – abhängig. Mit Erreichen der Erfassungsgrenze wird dokumentiert, dass ab dieser Analytkonzentration eine quantitative Bestimmung erfolgen kann. Ab der Bestimmungsgrenze schließlich ist eine Analytkonzentration erreicht, wobei eine geforderte relative Analysenpräzision gegeben ist. Man beachte bei den letztgenannten Grenzen, dass deren Angabe in einer Methode ohne Angabe der gewählten statistischen Sicherheit wenig Sinn macht. Mit der Angabe des Vertrauensbereiches wird die Ergebnisunsicherheit ausgedrückt.

Alle aufgeführten Verfahrensmerkmale werden in entsprechendem Normenwerk hinreichend behandelt. So wird die Bestimmung von Verfahrenskenngrößen für lineare Kalibrierfunktionen in DIN 38402 Teil 51, in DIN ISO 8466–2 die Kenndaten für die nichtlineare Kalibrierfunktion 2. Grades, in DIN 32645 die Berechnung von Nachweis-, Erfassungs- und Bestimmungsgrenze und in DIN ISO 5725–2 die Genauigkeit von Messungen behandelt. Im Rahmen der laborinternen Qualitätssicherung kann die Berechnung obiger Verfahrenskenndaten auf Basis der erwähnten Normen standardisiert werden.

Im Kontext der Reinigungsvalidierung ist unter allen Umständen die Verwendung validierter Analysenmethoden gefordert