Gensondentechnologie zum schnellen Nachweis pathogener Keime

Sicher ohne Salmonellen

24.03.2006 Der Nachweis von Salmonellen und Listerien im Rahmen der Qualitätskontrolle von Lebensmittelprodukten gewinnt ständig an Bedeutung, doch die konventionellen Standardverfahren nehmen zirka eine Woche oder mehr in Anspruch. Hohe Lagerkosten und immer kürzere Produktions- und Lieferzeiten verlangen nach schnelleren Verfahren, die dennoch einen zuverlässigen Befund gewährleisten.

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Als schnelles und zuverlässiges System zum Nachweis pathogener Keime hat sich in den letzten Jahren im Bereich der Lebensmittelanalytik die Gensondentechnologie etabliert. Testkits werden unter dem Namen (VIT Vermicon Identification Technology) angeboten. Offizielle Validierungsstudien haben jetzt gezeigt, dass die VIT-Methode den hohen Anforderungen gerecht wird.

Für den Test kommen so genannte Gensonden zum Einsatz, kleine DNA-Moleküle, die an einem Ende einen Fluoreszenzfarbstoff tragen. Sie dringen in die Bakterienzellen des Untersuchungsmaterials ein und binden dort an speziellen einzigartigen Signaturen auf dem Genmaterial der Zellen. Diese Bindung ist hochspezifisch, wodurch gewährleistet wird, dass nur die gesuchten Keime detektiert werden und keinerlei Kreuz-reaktionen mit anderen Bakterienarten auftreten. Durch dieses Verfahren werden nur lebende aktive Keime detektiert, wohingegen tote Zellen nicht erfasst werden. Dies unterscheidet das Test-System maßgeblich von anderen molekularbiologischen Verfahren (Bild links).
VIT-Salmonella erfasst hochspezifisch die gesamte Gattung Salmonella, während VIT-Listeria in einem Testansatz Listeria spp. sowie Listeria monocytogenes detektiert (Bilder rechts).

Studien zur Validierung der Gensonden-Nachweise

CCFRA (Campden & Chorleywood Food Research Association Group, Großbritannien) hat im Rahmen einer Studie die Spezifität von VIT-Salmonella und VIT-Listeria überprüft.

Zur Überprüfung von VIT-Salmonella wurden nicht weniger als 100 Salmonellen-Stämme herangezogen. Alle 100 Salmonellen-Stämme wurden mittels VIT-Salmonella richtig erkannt. Des weiteren wurden 30 Nicht-Salmonellen-Arten untersucht, die hauptsächlich zu den nah verwandten Enterobacteriaceae zählen, darunter auch Arten wie Citrobacter und E.coli, welche bei anderen alternativen Verfahren zu falsch-positiven Ergebnissen führen können. Keiner der 30 Stämme wurde mittels VIT-Salmonella detektiert.
Zur Überprüfung von VIT-Listeria wurden 50 Listerien-Stämme ausgewählt, darunter 25 Listeria monocytogenes-Stämme. Alle 50 Listerien-Stämme wurden als Listeria spp. erfasst. Sämtliche 25 L. monocytogenes-Stämme wurden ebenfalls korrekt identifiziert. Weiterhin wurden 30 Nicht-Listerien-Arten untersucht, welche allesamt nicht detektiert wurden.
Da viele Lebensmittelproduzenten die Analyse pathogener Keime an externe Prüflaboratorien vergeben, besteht auch seitens dieser Laboratorien ein stetig steigender Bedarf an schnelleren alternativen Methoden. Im G+S Prüflaboratorium wurde die Analyse mittels VIT-Salmonella im Rahmen einer Diplomarbeit hinsichtlich Spezifität und Sensitivität im Vergleich zur konventionellen Methode nach §35 LMBG validiert. Nach 22 Stunden Anreicherung in gepuffertem Peptonwasser und Rappaport-Vassilliadis-Bouillon wurde die VIT-Analyse durchgeführt, woraus letztlich nur eine gesamte Analysedauer von etwa 26 Stunden resultierte. Parallel dazu wurde die klassische Methode nach §35 LMBG durchgeführt, welche mindestens vier Tage mehr in Anspruch nahm.
Insgesamt wurden auf diese Weise 399 Lebensmittelproben aus der Routinearbeit parallel mittels VIT-Salmonella und der konventionellen Methode untersucht. In 20 Proben wurde mit beiden Methoden übereinstimmend eine Kontamination mit Salmonellen festgestellt. Alle übrigen Proben wurden mit beiden Methoden negativ bewertet. Bezogen auf die amtliche Nachweismethode nach §35 LMBG ergab sich dadurch eine Spezifität und Sensitivität des Tests VIT-Salmonella von jeweils 100%.
Unter Leitung des Instituts für Hygiene und Technologie der Lebensmittel tierischen Ursprungs, LMU München wurde eine umfassende Studie zur Validierung von VIT-Listeria durchgeführt. An dieser Studie nahmen sechs Laboratorien teil. Ziel der Studie war es, den Nachweis von Listeria monocytogenes mit VIT-Listeria mit den Ergebnissen der amtlichen Methode nach §35 LMBG zu vergleichen. Die Analyse von Listerien mittels VIT-Listeria erfolgt dabei nach insgesamt 48 Stunden Anreicherung in Halb-Fraser- und Voll-Fraser-Bouillon. Dagegen nimmt der Nachweis mit dem konventionellen Verfahren bis zu sieben Tage in Anspruch. Diese Studie zum Vergleich der beiden Methoden wurde in zwei Teile untergliedert:
Im ersten Studienteil wurden insgesamt 359 Proben untersucht, die größtenteils aus der Laborroutine stammten. Darunter waren 109 Umgebungsproben sowie 250 Lebensmittelproben (Fleisch und Fleischprodukte, Fisch sowie Käse und andere Molkereiprodukte). In insgesamt 92 der untersuchten Proben wurde mit beiden Verfahren L. monocytogenes nachgewiesen. Zudem wurde in neun weiteren Proben mittels VIT-Listeria L.monocytogenes nachgewiesen, während dieser Nachweis mit der konventionellen Methode nicht gelang.
Im zweiten Studienteil wurde ein Ringversuch durchgeführt. Je fünf Proben wurden hierzu künstlich mit L. monocytogenes in unterschiedlichen Konzentrationen kontaminiert (je eine Probe wurde nicht beimpft) und jeweils ein Teil dieser Proben an alle sechs Laboratorien verteilt. In allen positiven Proben konnte mit beiden Verfahren L. monocytogenes nachgewiesen werden. Im Vergleich zum quantitativen konventionellen Verfahren wurde deutlich, dass auch bei geringen Ausgangskeimzahlen von < 10/g ein eindeutiger Nachweis mittels VIT-Listeria erzielt wurde.

Anwendung der Gensondenmethode in der Praxis

Bei der Herstellung von Eiprodukten ist die Salmonellen-Analyse der wichtigste mikrobiologische Parameter. Ein international agierender Produzent hat VIT-Salmonella etabliert, um Flüssigei-Produkte deutlich schneller als zuvor auf Salmonellen zu untersuchen. Nach Anreicherung der Probe in gepuffertem Peptonwasser über Nacht und einer kurzen Anreicherung in Rappaport-Vassilliadis-Bouillon für zirka fünf Stunden erfolgt die Analyse. Die Salmonellen-Analyse ist damit bereits am zweiten Untersuchungstag beendet, was eine Zeitersparnis von mehr als zwei Tagen im Vergleich zur konventionellen Analyse bedeutet. Diese kurze Analysedauer ermöglicht ein wesentlich schnelleres und damit auch flexibleres Qualitätsmanagement mit entsprechend geringeren Lagerkosten. Selbst im unwahrscheinlichen Fall eines positiven Befunds besteht nunmehr die Möglichkeit zu reagieren, bevor das Produkt den Kunden erreicht.

Die Rügenwalder Wurstfabrik nutzt die VIT-Produkte zum Nachweis von Salmonellen und Listerien, wobei vor allem die pathogene Art Listeria monocytogenes von Bedeutung ist. Mittels VIT-Salmonella wird nach insgesamt nur zirka 25 Stunden Anreicherung der Probe in gepuffertem Peptonwasser und Rappaport-Vassilliadis-Bouillon zunächst das Wurstbrät untersucht. Im Falle eines positiven VIT-Befundes besteht noch ausreichend Zeit, die betroffenen Chargen in den Räucherwägen auf dieselbe Weise zu analysieren. Dadurch können noch vor Auslieferung der Ware die kontaminierten Teilchargen identifiziert und vernichtet werden. Auf Grund der Schnelligkeit des Verfahrens konnte ein sehr effektives und flexibles Qualitätsmanagement etabliert werden.

VIT-Listeria wird neben der Produkt-Kontrolle auch zur Kontrolle der Rohware im Rahmen eines Monitorings von Listeria monocytogenes eingesetzt. Nach nur insgesamt 48 Stunden Anreicherung der Probe in Halb- und Voll-Fraser wird das VIT-System angewandt, um in einem Testansatz Listeria spp. sowie L. monocytogenes zu detektieren. Dadurch kann eine mögliche Kontamination des Produkts zeitnah bereits zu Beginn der Produktion erkannt werden. Des weiteren dient dieses Monitoring dazu, das Gefährdungspotenzial der Rohwaren hinsichtlich einer Kontamination mit L. monocytogenes zu analysieren.

Heftausgabe: März-April 2006
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Über den Autor

Dieter Sedlmair , Produktmanager,Vermicon
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