Das Abtrennen von Zellresten geschieht midstream zwischen Fermentation und Produktaufreinigung.
- Der Einsatz von Filterhilfsmitteln für die sogenannte Alluvial-Filtration steigert die Effizienz beim Abtrennen von Zellmaterial nach der Fermentation: Der Differenzdruck steigt während der Filtration langsamer an, so dass mehr Volumen pro Filterfläche filtriert werden kann, bevor der Filter verblockt.
- Scale-up und Optimierung vom Entwicklungs- in den Prozessmassstab fallen mit dieser Methode leicht, da sich die Filter unterschiedlicher Größenordnungen proportional zueinander verhalten.
Dieser Zwischenschritt, der Midstream-Prozess, ist einer der wichtigsten Prozessschritte in der biotechnologischen Produktion. Der Einsatz von Zellkulturen zur Herstellung von Therapeutika und Diagnostika ist weit verbreitet. Hierfür werden häufig Säugerzellkulturen eingesetzt, aber ebenso finden sich Systeme, die auf Mikroben, efen oder Insektenzellen basieren. Diese Zellen oder deren Reste gilt es nach erfolgter Fermentation aus dem Medium abzutrennen.
Zwischen Up- und Downstream
Bei der Auslegung des Prozesses für die einzelnen Zellsysteme stellen sich häufig dieselben Fragen nach Prozesseffizienz, Prozessrobustheit, ökonomische Durchführbarkeit und nach rechtlichen Aspekten. Herausforderungen für die Prozesseffizienz sind immer höhere Zelltiter, Menge an Zellbruchstücken, Skalierbarkeit, Robustheit und Flexibilität. Prozesse sollten möglich Robust und Flexibel ausgelegt werden um auf Prozessänderungen und zukünftige Prozessadaptionen und –optimierungen einfach und schnell reagieren zu können. Im Zuge kontinuierlicher Prozessoptimierung stoßen Standardtechnologien zur Midstream-Zellentfernung wie Zentrifugation, Separation, Membran- und Tiefenfiltration bei den immer höheren Partikelbelastungen
(> 108 Zellen/ml) jedoch an Ihre Grenzen.
Eine effiziente Methode zur Zellentfernung ist die Alluvial-Filtration. Diese etablierte und sehr ökonomische Art der Tiefenfiltration kommt bereits in der pharmazeutischen Industrie zum Beispiel in der Plasmafraktionierung zum Einsatz. Anstelle eines immobilisierten Tiefenfiltermediums kommt dabei ein Filterhilfsmittel wie Kieselgur zum Einsatz. Dieses bildet während der Filtration einen Filterkuchen. Der Filterkuchen ist der eigentliche Filter während der Filtration, der Tiefenfilter dient hier als Supportschicht. Dadurch hat die Alluvial-Filtration eine wesentlich höhere Kapazität für hohe Partikelbelastungen und speziell für kompressible Partikel wie Mikroben oder Säugerzellen. Eine Möglichkeit zur Alluvial-Filtration bietet das Single-use-System Filtrodisc Bio SD des Filterherstellers Filtrox.
Funktionsprinzipien von Standard-Tiefenfiltration und Alluvial-Filtration.
Filtration im Vergleich
Filtrationsversuche mit Standard-Tiefenfiltration und Alluvial-Filtration zum Abtrennen von Zellen und Zellbruchstücken zeigen die unterschiedliche Effizienz beider Verfahren. Dazu wurde das Kieselgur mit dem Unfiltrat gemischt und anschliessend bei einer konstanten Flussrate von 10 bis 12 ml/min mit einer Peristaltikpumpe über eine Filterkapsel gepumpt. Dies entspricht einer Flussrate von 300 bis 350 l/m2h. Ab einem Differenzdruck von 2 bar gilt der Filter als verblockt. Das filtrierte Volumen wurde gravimetrisch bestimmt.
Der Differenzdruck steigt bei beiden Verfahren unterschiedlich an: Bei der Standard-Tiefenfiltration mit einer Fermentationsbrühe mit ca. 107 Zellen verblockt der Filter bei der Standardtiefenfiltration bereits nach 41 min. Die Alluvial-Filtration erreicht nach dieser Zeit etwa einen Differenzdruck von 0.6 bar und ist weit entfernt von einem Verblocken des Filters. Einen linearen Anstieg des Differenzdruckes vorausgesetzt, würden die 2 bis 2,5 bar und damit ein verblockter Filter nach ca. 152 min erreicht. Dies deutet darauf hin, dass sich mit der Alluvial-Filtration die Filtrationszeit und somit auch das filtrierte Volumen pro Filterfläche um fast das Vierfache steigern lässt.
Versuchsaufbau mit einer 2“-Kapsel.
Scale-up und Optimierung
Die Versuche zeigen ebenfalls eine Linearität des Anstieges. Dadurch fällt mit dem Single-use-Filtersystem das Scale-up und die Optimierung während der Prozessentwicklung leicht. Das Filterkuchenvolumen pro Liter Filtrat, welches während der Laborversuche ermittelt wurde, ist direkt proportional zu dem Filterkuchenvolumen, welches in der Produktion anfällt. Der primäre Fokus ist nicht die Kalkulation von benötigter Filterfläche, sondern des benötigten Filterkuchenvolumens. Daraus ergibt sich die benötigte Filterfläche. Eine pH-Änderung oder der Einsatz von Flockungsmitteln ist nicht notwendig. Während der Entfernung von Zellen oder Zellbruchstücke lassen sich mit dem Filtersystem auch andere verunreinigende Bestandteile wie HCP oder DNA entfernen, was downstream weitere Kosten senkt.
Unterschiedlicher Anstieg des Differenzdrucks bei Standard-Tiefenfiltration undAlluvial-Filtration. (Bilder: Filtrox)
Fazit: Der Einsatz von Alluvial-Filtration (Kuchenfiltration) im Midstream-Prozess ist eine effiziente, kostengünstige, robuste und einfach anzuwendende Methode zur Entfernung von Zellen oder Zellbruchstücken. Das Single-use-Mikrofiltrationssystem kombiniert die Vorteile der Standardtiefenfiltration mit der Alluvial-Filtration. Dies führt zu neuen Möglichkeiten im Midstream- wie auch im Downstream-Prozess. Anstelle eines zweistufigen Prozesses wie Zentrifuge und Tiefenfilter ist der Aufreinigungsprozess in einem Schritt ohne Zentrifuge möglich.
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