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Mycoplasmenkontrolle in der Filtration von Zellkulturmedien

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18.02.2010 Der Einsatz größerer Bioreaktoren mit höheren Zellkulturtitern prägte die Entwicklungen der letzten Jahre. Der Trend bewirkt eine Wertsteigerung der Produktionschargen. Insbesondere die Medienfiltration für Säugerzellkulturen erfordert daher Sterilfilter mit hoher Filterkapazität, die eine maximale Sicherheit gegenüber Kontaminationen bieten. Welche Faktoren sind bei der Auswahl geeigneter Sterilfilter für die Medienfiltration zu berücksichtigen?

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Entscheider-Facts Für Anwender


  • Der neue Fluorodyne EX EDT-Sterilfilter wurde für Anwendungen entwickelt, die eine hohe Sicherheit gegenüber Kontaminationen mit Mycoplasmen erfordern.
  • Das Filterdesign des neuen Sterilfilters nutzt die Ultipleat-Membranfaltung, die die effektive Filterfläche gegenüber der konventionellen Starpleat-Faltung erhöht und die mechanische Stabilität verbessert.
  • Aufgrund der hohen Kapazität der Filtermembran und der großen Filterfläche pro Filterelement reduziert sich die erforderliche Anzahl an Filterelementen zur Filtration eines definierten Volumens an Zellkulturmedien; dies bedeutet ein erhebliches Kostensenkungspotenzial.
  • Die Prozesssicherheit, die Prozesskosten und die Bedienerfreundlichkeit lassen sich durch den Einsatz modernster Technologien für die Mycoplasmenfiltration auf einfache Weise steigern.

Die Gefahr einer Kontamination von Zellkulturen mit Mycoplasmen stellt einen kritischen Aspekt in biotechnologischen Produktionsprozessen dar. Mycoplasmen sind prokaryontische Bakterien aus der Klasse der Mollicutes (lat. mollis, „weich“; cutis, „Haut“), die chronische Infektionen bei Menschen und Tieren auslösen. Als potenzielle Kontaminationsquellen gelten Medienkomponenten pflanzlichen – zum Beispiel Sojapeptone – und tierischen Ursprungs – zum Beispiel Serum – sowie die Arbeitsumgebung in den Produktionsstätten, etwa dem Operator. Die Detektion von Mycoplasmen ist schwierig, zumal die Grenzwerte anerkannter Verfahren verhältnismäßig hoch sind (>10 KBE/ml). Somit kann selbst ein negatives Testergebnis die völlige Abwesenheit von Mycoplasmen nicht verlässlich gewährleisten. Darüber hinaus treten keine Änderungen des pH-Werts oder der Trübung auf. Andererseits aber können sich physiologische und morphologische Parameter der infizierten Zellen ändern und einen negativen Einfluss auf den Zellstoffwechsel und das Zellwachstum ausüben.

In der Praxis ist eine Hitzesterilisation der Zellkulturmedien oder deren Rohmaterialien zur Senkung des Kontaminationsrisikos sinnvoll. Im Falle hitzelabiler Medienkomponenten erfolgt eine Sterilisation durch Direktflussfiltration unter Einsatz eines geeigneten Membransterilfilters. In diesem Fall wird das Zellkulturmedium aus dem Mischtank direkt über den Sterilfilter in den Bioreaktor befördert. In einigen Anwendungen erfolgt zusätzlich eine Pasteurisierung, die den Sterilfilter zur Senkung des Viruskontaminationsrisikos kurzzeitig (etwa 10 s) einer erhöhten Temperatur (etwa 70 °C) aussetzt. Der Filter fungiert in beiden Fällen als Sterilbarriere um den Bioreaktor.

Kontaminationsrisiken in der Medienfiltration

Aufgrund einer fehlenden starren Zellwand sind Mycoplasmen leicht deformierbar. Sie können daher herkömmliche 0,2-µm-Sterilfilter penetrieren und auf diesem Wege in den Fermenter gelangen, wo sie infolge der langen Fermentationszeiten von Säugertierzellen sehr hohe Zelldichten erreichen. Am weitesten verbreitet ist daher der Einsatz feinerer 0,1-µm-Membranen, deren Leistungsfähigkeit der zugehörige Log Reduction Value (LRV) dokumentiert. Der LRV basiert auf der Titerreduktion, die das Verhältnis der Anzahl der Keime vor der Filtration und der Anzahl der Keime nach der Filtration beschreibt. Je höher der LRV, desto geringer ist das Kontaminationsrisiko, sodass beispielsweise ein Filter mit einem LRV >10 für eine spezifische Beaufschlagung mit Mycoplasmen eine 10000-fach höhere Sicherheit als ein Filter mit einem LRV >6 und eine 1000-fach höhere Sicherheit als ein Filter mit einem LRV >7 liefert.

Was bedeutet das in der Praxis? Im günstigsten Fall einer Detektionsgrenze für Mycoplasmen von 10 KBE/ml könnten 1000 Liter Zellkulturmedium – als praxisnahes Beispiel – bis zu 107 Keime enthalten. Ein Filter mit einem LRV >10 bietet in diesem Szenario den erforderlichen Schutz gegen Kontaminationen, während ein Filter mit einem LRV >7 oder ein Filter mit einem LRV >6 die Anforderung nicht verlässlich erfüllen kann.

Fortschritt in derMycoplasmenkontrolle

Der neue Fluorodyne EX EDT Sterilfilter wurde für Anwendungen entwickelt, die eine hohe Sicherheit gegenüber Kontaminationen mit Mycoplasmen erfordern. Es handelt sich um einen 0,1µm Hybridfilter mit asymmetrischer machV-Polyethersulfon- (PES) Vorfilterlage für sehr hohe Kapazitäten und Standzeiten sowie zwei Polyvinylidendifluorid- (PVDF) Endfilterlagen für maximale Sicherheit und Flussleistung. Die Entwicklungsarbeiten fokussierten auf der Abscheideleistung für Mycoplasmen und der Standzeit.

Die Leistungsdaten des Filters wurden mit Mycoplasmen menschlichen, pflanzlichen und tierischen Ursprungs validiert. Die Titerreduktion für Mycoplasmen liegt bei >1010 für Acholeplasma laidlawii (ATCC 23206) und Mycoplasma orale (ATCC 23714), Letzteres eine typische Prozessverunreinigung, die durch den Operator in den Prozess eingebracht werden kann. Darüber hinaus ist der Filter als Sterilfilter für pharmazeutische Anwendungen gemäß der anerkannten Industriestandards mit Brevundimonas diminuta (ATCC 19146) validiert. An dieser Stelle ist wichtig anzumerken, dass zur Charakterisierung von Mycoplasmenfiltern kein Industriestandard existiert. Zwar ist Acholeplasma laidlawii aufgrund seiner einfachen Kultivierbarkeit seit 30 Jahren ein verbreiteter Testorganismus für Beaufschlagungsstudien mit 0,1-µm-Filtern, doch ist weder eine Kultivierungsmethode noch eine Mindestabscheideleistung definiert. Der Vergleich verschiedener Mycoplasmenfilter erfordert daher eine genaue Betrachtung ihrer Validierungsverfahren und Spezifikationen.
Das Filterdesign des neuen Sterilfilters nutzt die Ultipleat-Membranfaltung, die die effektive Filterfläche gegenüber der konventionellen Starpleat-Faltung erhöht und die mechanische Stabilität verbessert. Darüber hinaus wurde das Narrow-Core-Konzept eines Stützkörpers mit verkleinertem Innendurchmesser umgesetzt. Auf diese Weise konnte eine Filterfläche von 0,95 m² pro 10-Zoll-Filterelement realisiert werden. Ein separater Vorfilter ist in den meisten Anwendungen nicht erforderlich, sodass sich das Filtersystem kleiner auslegen lässt und zudem die Integration in Einwegsysteme vereinfacht wird.

Filterkapazitäten im Vergleich

Das maximal filtrierbare Flüssigkeitsvolumen pro Filterfläche, das die Kapazität eines Filters definiert, kann im Falle von Zellkulturmedien bei mehreren Tausend Litern pro Quadratmeter Filterfläche liegen. Die Verblockungstendenz erhöht sich dabei mit steigenden Mengen an Antischaummitteln, Glukose, Peptonen oder Serum, die somit die Filterkapazität verringern. Eine Studie auf Membranscheiben verglich die Leistungsfähigkeit des neuen Filters mit der zweier Wettbewerbsfilter mit Mycoplasma Claim (EDT: LRV >10; Filter B: LRV >6; Filter C: LRV >7). Sie untersuchte die Filtration verschiedener Zellkulturmedien durch die jeweiligen Filter unter konstantem Differenzdruck und dokumentiert signifikante Leistungsunterschiede.

Mit allen drei Zellkulturmedien zeigte die Fluorodyne EX EDT Filtermembran die höchste Kapazität. Diese Leistungsvorteile verstärken sich, wenn statt Membranscheiben mit gleicher Filterfläche 10-Zoll-Filterelemente zum Einsatz kommen, die sich hinsichtlich ihrer Falttechnologie und Filtergeometrie und somit hinsichtlich ihrer Filterfläche unterscheiden. Anders als der Fluorodyne EX EDT Filter nutzen Filter B und Filter C die herkömmliche sternförmige Membranfaltung und das konventionelle Filterelementformat. Die Filterfläche pro 10-Zoll-Filterelement ist daher im Falle des Fluorodyne EX EDT Filters am größten (EDT: 0,95 m²; Filter B: 0,49 m²; Filter C: 0,60 m²). In der Folge reduziert sich die erforderliche Anzahl an Filterelementen zur Filtration eines definierten Volumens an Zellkulturmedien. Das Filtersystem kann kleiner ausgelegt, der Gesamtprozess vereinfacht und die Wirtschaftlichkeit gesteigert werden.

Vorzüge kleiner Systemauslegung

Eine geringere Anzahl an Filterelementen birgt neben dem verringerten Platzbedarf ein erhebliches Kostensenkungspotenzial: geringere Investitionskosten (auch für kleinere Filtergehäuse), niedrigere Kosten für die Entsorgung und Lagerung sowie niedrigere Kosten für Wasser für Injektionszwecke (WFI), das zur Vorspülung, das Steaming-in-Place (SIP), die Filterspülung für den Integritätstest und das Cleaning-in-Place (CIP) benötigt wird. Der Prozess lässt sich aus Anwendersicht darüber hinaus einfacher handhaben. Die Filtration von Zellkulturmedien macht es somit erforderlich, verschiedene Aspekte in einer Gesamtbetrachtung zu berücksichtigen. Die Prozesssicherheit, die Prozesskosten und die Bedienerfreundlichkeit lassen sich durch den Einsatz modernster Technologien für die Mycoplasmenfiltration auf einfache Weise steigern.

 

Heftausgabe: Februar 2010
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Über den Autor

Dr. Dirk Sievers ,Marketing Manager
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