doppelt im Vorteil

Strategien zur Abtrennung von Zellen und Klärung von Zellextrakten

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12.06.2008 Der Einsatz von Tiefenfiltern zur Zellabtrennung und Zellextraktklärung hat sich infolge wichtiger Anwendungsvorteile als routinemäßige Aufreinigungstechnik in der biopharmazeutischen Industrie etabliert. Im Falle breiter Partikelgrößenverteilungen, die bei der Zellernte von eukaryotischen Zellsuspensionen charakteristisch sind, bieten insbesondere doppellagig konzipierte Tiefenfilter wichtige Leistungsvorteile. Sie stehen für eine schnelle und sichere Aufreinigung, die ohne vorgeschaltete Zentrifugation auskommen kann und zudem bemerkenswerte wirtschaftliche Vorteile bietet.

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Die Fortschritte in der biopharmazeutischen Produktion mit Zellkulturen führten in den zurückliegenden Jahren zu einer deutlichen Steigerung der Proteintiter (bis 10g/l), der Zelldichten (bis 107Zellen/ml) und der Zellkulturvolumina (bis 20000l). Die Anforderungen an die Aufreinigung sind folglich anspruchsvoller geworden. In vielen Betrieben werden mittlerweile routinemäßig die Vorteile der modernen Tiefenfiltration genutzt, die damit der früher weit verbreiteten Querstromfiltration mit Hilfe von Kassetten, Hohlfasern oder Keramiken den Rang abgelaufen hat. Das Leistungspotenzial der modernen Tiefenfiltration zeigt sich insbesondere in den Fällen, in denen es um die Aufreinigung komplexer Zellsuspensionen geht, die ihren Wertstoff extrazellulär ausbilden (insbesondere bei Säugerzellen). Die Aufkonzentrierung von Zellen, die intrazelluläre Wirkstoffe produzieren (insbesondere bei Bakterienzellen), bleibt auch weiterhin der Querstromfiltration vorbehalten.

Tiefenfilter müssen strengsteAnforderungen erfüllen

Der Aufbau moderner Tiefenfilter basiert auf einer Zellstoffmatrix, in die Kieselgur oder Perlite unter Verwendung von Harzen eingearbeitet sind. Die Filtrationseigenschaften werden durch die Wahl des Kieselgurs oder der Perlite bestimmt. Kieselgur wird vorwiegend für feinere Schichten verwendet, Perlite hingegen für offenere Schichten. Alle Tiefenfilter, die für die pharmazeutische Industrie hergestellt werden, müssen strengste Anforderungen erfüllen. Spezielle Produktionsbedingungen, zu denen unter anderem das Spülen der Schichten mit RO-Wasser während des Herstellungsprozesses zählt, gewährleisten höchste Reinheit. Alle pharmazeutischen Schichten weisen einen äußerst niedrigen Gehalt an Endotoxinen auf, der mit <0,06EU/ml unterhalb der Nachweisgrenze liegt. Sie erfüllen die Anforderungen der USP (United States Pharmacopeia) für Klasse VI Kunststoffe (121°C). Der Anteil extrahierbarer Bestandteile ist auf ein Minimum reduziert.

Moderne Tiefenfilter zeichnen sich durch hohe Schmutzaufnahmekapazitäten und lange Standzeiten aus. Ihre Anwendung im Einwegbetrieb minimiert den Aufwand für Reinigung und Reinigungsvalidierung. Das Angebot an Tiefenfiltern umfasst sowohl einlagige als auch doppellagige Konfigurationen, wobei die Verwendung einlagiger Kapsulen oder Module eine ausreichende Vorklärung der Zellsuspensionen voraussetzt.

Einlagige und doppellagigeTiefenfilter im Vergleich

In der Praxis werden hierfür zumeist Zentrifugen verwendet. Ein Verzicht auf eine solche Vorklärung direkt nach der Fermentation bringt in der Regel eine breitere Partikelgrößenverteilung in der Zellsuspension mit sich. Die Tiefenfiltration erfolgt daher sinnigerweise mit doppellagigen Kapsulen oder Modulen, die durch Kombination zweier unterschiedlicher Filterschichten eine deutliche Steigerung der Filtrationsleistung erlauben. Ein Modellversuch zur Filtration eines Zellaufschlusses einer Hefesuspension verdeutlicht die Vorteile der doppellagigen Tiefenfilterschichten für die Primärabtrennung ohne Zentrifuge, d.h. bei breiter Partikelgrößenverteilung. Hierfür wurden drei Tiefenfilterkapsulen mit Filterschichten unterschiedlicher Permeabilität eingesetzt, die mit einer Filterfläche von 26cm2 speziell für die Prozessentwicklung konzipiert sind. Sie erlauben es, die für eine Anwendung am besten geeigneten Tiefenfilterschichten zu bestimmen und die für den Prozessmaßstab erforderliche Filterfläche präzise zu skalieren.

Die K100P-Kapsule enthält eine einlagige feinere Filterschicht (Abscheiderate: 1 bis 3µm nominal; Wasserpermeabilität: 149l/(m²min) bei 1bar Differenzdruck), die K900P-Kapsule eine einlagige offenere Filterschicht (Abscheiderate: 8 bis 20µm nominal; Wasserpermeabilität: 1980l/(m²min) bei 1bar Differenzdruck). Die doppellagige PDK5-Kapsule kombiniert die beiden einlagigen Schichten, wobei die offenere Schicht als Vorfilter auf die feinere Schicht aufgebracht ist. Der verwendete Zellaufschluss einer Hefesuspension zeigte eine Trübung von >2000NTU (Nephelometric Turbidity Units). Die Filtration erfolgte mittels einer Schlauchpumpe bei einer Flussrate von 10 ml/min parallel über die drei Tiefenfilterkapsulen.
Innerhalb der 20-minütigen Filtrationszeit konnten deutliche Unterschiede zwischen den verschiedenen Filtern hinsichtlich Druckverlauf und Filtratvolumen beobachtet werden. Wurden bei der Filtration über die doppellagige PDK5-Kapsule 146ml klares Filtrat erhalten, nahm der Druck bei der Filtration über den einlagigen feinen K100P-Filter nach wenigen Minuten deutlich zu, so dass innerhalb der Gesamtversuchszeit nur 73ml Filtrat erhalten wurden. Der einlagige offene K900P-Filter erlaubte zwar die Filtration des größten Volumens (173ml), doch wurde nach nur 5min ein erster Trübungsdurchbruch beobachtet, der im weiteren Verlauf deutlich zunahm. Die Filtrate der PDK5- und K100P-Filter blieben dagegen über den gesamten Filtrationsverlauf klar.

Doppellagiger Tiefenfilter habenVorteile

Der Versuch macht die Vorteile doppellagiger Tiefenfilter bei der Filtration von Lösungen mit breiter Partikelgrößenverteilung deutlich. Diese sind charakteristisch für die Zellabtrennung und Zellextraktklärung, insbesondere wenn diese ohne vorherige Zentrifugation direkt nach der Fermentation durchgeführt werden. Der Einsatz eines doppellagigen Tiefenfilters ersetzt dabei zwei in Serie geschaltete Filtrationen, wobei die offenere Schicht als Vorfilter dient, der die Verblockung des zweiten feineren Hauptfilters verhindert. Auf diese Weise lassen sich mit doppellagigen Filtern bis zu 4,5-fach längere Standzeiten gegenüber einlagigen Filtern erreichen. Sollte zur Vorklärung dagegen eine bereits vorhandene Zentrifuge genutzt werden, können je nach deren Fahrweise und Trennleistung einlagige oder feinere doppellagige Tiefenfilter die optimale Schutzwirkung auf die nachgeschaltete Membranfiltration erbringen und somit die optimale Wirtschaftlichkeit sicherstellen.

Im Anschluss an die Bestimmung des optimalen Tiefenfilters mit den kleinen Supracap 60 Kapsulen (26cm²) lässt sich eine einfache und schnelle Aufskalierung durchführen. Hierfür stehen dem Anwender die größeren Supracap 100 Tiefenfilterkapsulen (500 bis 2700cm²) sowie die 12“ und 16“ Supradisc Tiefenfiltermodule (0,3 bis 5,0m²) zur Verfügung, die das direkte Übertragen des Verfahrens vom Labormaßstab in den Prozessmaßstab ermöglichen.

Heftausgabe: Juni 2008
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Über den Autor

Dr. Christina Bruntner , Separation Technology Specialist Pall Life Sciences
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