- Die Hochleistungs-Anionenaustauschchromatographie mit anschließender gepulster amperometrischer Detektion ermöglicht die empfindliche Bestimmung zahlreicher Kohlenhydrate in verschiedenen Lebensmitteln.
- Je nach Matrix stehen unterschiedliche automatisierbare Inline-Probenvorbereitungstechniken zur Verfügung.
- Während die meisten Lebensmittelproben vor der ionenchromatographischen Trennung lediglich verdünnt, filtriert oder extrahiert werden müssen, bietet sich für komplexere Proben die patentierte Stopped-Flow-Dialyse an.
Kohlenhydrate oder Saccharide sind die in der Biosphäre am weitest verbreiteten organischen Moleküle. Aufgrund dieser Verbreitung und der Bedeutung der Kohlenhydrate erfordert beispielsweise die Qualitätskontrolle von Lebensmitteln eine zuverlässige und schnelle Analyse; auch ihre Bestimmung in der medizinischen Forschung ist von Interesse. Die am häufigsten eingesetzten Analysenverfahren zur Kohlenhydratbestimmung sind die Magnetische Kernresonanzspektroskopie (1H-NMR), Fourier-Transfom-IR-Spektroskopie (FT-IR), Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) sowie Gas- und Flüssigkeitschromatographie mit anschließender Massenspektrometrie. Während spektroskopische Methoden mit hohen Betriebskosten verbunden sind und hochqualifiziertes Personal voraussetzen, erfordern gaschromatographische Verfahren zeitaufwendige Derivatisierungen. Aufgrund dieser Nachteile wird für Kohlenhydratbestimmungen zunehmend die Hochleistungs-Anionenaustauschchromatographie eingesetzt. In stark alkalischen mobilen Phasen werden Zuckeranionen mittels eines positiv geladenen, starken Anionenaustauscherharzes getrennt.
Der empfindliche und direkte Nachweis der getrennten Kohlenhydrate war lange Zeit eine Herausforderung. Während fehlende Chromophore und Fluorophore den Einsatz von UV- und Fluoreszenzdetektoren verhindern, sind Brechungsindexdetektoren wenig empfindlich und für Gradientenanwendungen nicht geeignet. Nachsäulenderivatisierungen ermöglichen zwar die empfindliche spektrophotometrische Detektion, sind allerdings mit arbeitsintensiven und fehleranfälligen Derivatisierungen verbunden. Da Kohlenhydrate elektrochemisch aktiv sind, lassen sich die geschilderten Schwierigkeiten mittels elektrochemischer Detektion an einer Goldelektrode umgehen. Hierzu kommt ein Verfahren zum Einsatz, das als gepulste amperometrische Detektion (pulsed amperometric detection, PAD) bezeichnet wird. Die Detektion der Analyten erfolgt durch Anlegen einer positiven Spannung E1. Darauf folgt ein stärkerer Impuls E2 zur oxidativen Desorption von adsorbierten Spezies und schließlich eine dritte, negative Spannung E3 zur Reaktivierung der Elektrodenoberfläche. Neben der Bestimmung von Kohlenhydraten eignet sich die amperometrische Detektion auch zum empfindlichen Nachweis von Aminozuckern, Aminosäuren, biogenen Aminen, schwefelhaltigen Spezies, Alkoholen und diversen Antibiotika.
Kohlenhydrate in einem Malzextrakt
Die aus gekeimter Gerste isolierten viskosen oder getrockneten Malzextrakte enthalten natürlich vorkommende Enzyme, insbesondere Amylase, welche Stärke in wasserextrahierbare Zucker umwandeln. Malzextrakte haben einen hohen Nährwert und sind ein sehr wichtiger Zusatz in Kinder- und Haustiernahrung, Broten, Instant-Kaffee, Getränken, Eis und Arzneimitteln.
Die Probenvorbereitung von Malzextrakten ist einfach und erfordert einzig eine Verdünnung. Anschließend lässt sich die Probe direkt injizieren. Für den Süßegrad sind in erster Linie Glucose, Fructose und Sucrose verantwortlich. Da letztere nicht in nachweisbaren Konzentrationen vorhanden sind, werden Malzextrakte von Verbrauchern „nur halb so süß“ wie die vorwiegend sucrosehaltigen Produkte wahrgenommen. Neben Glucose und Maltose enthält der untersuchte Malzextrakt mehrere Maltooligosaccharide. Das Saccharidprofil der untersuchten Probe entspricht der allgemeinen Zusammensetzung von Malzextrakten.
Bestimmung bei Milchprodukten
Im Gegensatz zur einfachen Probenvorbereitung von Malzextrakten ist die Analyse der Kohlenhydrate in proteinhaltigen Milchprodukten etwas anspruchsvoller. Bei Direktinjektion auf die Säule fallen die in Milchprodukten vorhandenen Proteine in der stationären Säulenphase aus und beeinträchtigen Trennleistung und Lebensdauer der Säule. Durch vorgeschaltete Fällungsverfahren lässt sich dies zwar vermeiden, jedoch sind die Verfahren arbeitsaufwendig, führen zu Mitfällungen, Einschlüssen und einem erhöhtem Zuckerabbau.
Dagegen lässt sich eine störungsfreie Bestimmung der Kohlenhydrate durch Inline-Eliminierung der unerwünschten Matrixkomponenten mittels Stopped-Flow-Dialyse erzielen. Die Technik beruht auf der selektiven Diffusion von Molekülen oder Ionen von einer Lösung durch eine Membran in eine andere Lösung. Die Triebkraft des Transfers ist das Konzentrationsgefälle über die Membran; deren Dicke und Porosität bestimmen die Qualität der Matrixabtrennung.
Im Unterschied zu dynamischen Dialysen, bei welchen die beiden Lösungen fortlaufend durch das Dialysemodul strömen, wird bei der Stopped-Flow-Dialyse die Akzeptorlösung gestoppt, bis die Konzentration auf beiden Seiten der Membran gleich ist. Das Verfahren dauert maximal 14 min und lässt sich direkt an ein Ionenchromatographie (IC)-System koppeln. Da die chromatographische Trennung parallel zur Dialyse der nachfolgenden Probe abläuft, verlängert sich die gesamte Analysendauer nur unwesentlich.
Ein Beispiel: Beim Chromatogramm eines Fruchtjoghurt-Dialysats (s. Abb. 2) zeigen sich Peaks des Polyols Inositol, des Zuckeralkohols Sorbitol und der Mono- und Disaccharide Glucose, Galactose, Fructose, Lactose und Sucrose. Mehrfachinjektionen ergeben konstante Peakflächen, Peakhöhen und Retentionszeiten und belegen die quantitative Abtrennung der Proteinmoleküle. Die bestimmten Kohlenhydrat-Wiederfindungsraten zwischen 95 und 105 % unterstreichen die quantitative Permeabilität der Membran für Kohlenhydrate.
Lebensmittel- und Getränkeprodukten
Das IC-System bietet viele Anwendungsmöglichkeiten für die Bestimmung von Kohlenhydraten in Getränken, Lebens- und Genussmitteln sowie Süßigkeiten. Anders als die oben erwähnte Proteinmatrix in Milchprodukten erfordern die meisten Lebensmittelproben nur Probenvorbereitungstechniken wie Zerkleinern, Verdünnen, Extrahieren, Filtrieren und die Behandlung mit Ultraschall. Überdies ermöglicht die Stopped-Flow-Dialyse den Nachweis von Kohlenhydraten in Pflanzenextrakten, Blut, Urin, pharmazeutischen Produkten, Sprengstoffen oder Biokraftstoffen.