Analysegerät

Verbrennungs-Elementaranalysator Unicube trace von Elementar. (Bild: Elementar)

Entscheider-Facts

  • Mit den beschriebenen Elementaranalysatoren ist der Nettopeptidgehalt, der für die richtige Dosierung von Peptidwirkstoffen in Therapeutika essenziell ist, hochgenau und GMP-konform zu ermitteln.
  • Dank minimaler manueller Zuarbeit lässt sich die Nettopeptidbestimmung mittels Elementaranalyse leicht in die Abläufe der Produktion integrieren.
  • Aufgrund großer Fortschritte in der Empfindlichkeit der Geräte, genügen mittlerweile Probenmengen von weit unter 1 mg Peptidpulver für die Analyse. Damit ist diese Analysetechnik auch für kleinste Peptidchargen zugänglich.

Seit einigen Jahren stehen Peptide als Wirkstoffe vermehrt im Fokus, da sie synthetisch einfach herzustellen sind und vielfältige Prozesse im Körper beeinflussen. Peptide sind Ketten von 2 bis 100 Aminosäuren, die über Peptidbindungen verbunden sind. Die biologischen Eigenschaften von einzelnen Peptiden hängen von der Anzahl der Aminosäuren und von deren Position in der Kette ab. Darüber hinaus ist - wie auch bei jedem anderen Wirkstoff - die richtige Dosis entscheidend. So gibt es Peptide, die u.a. eine krebshemmende, antikariogene, cholesterinsenkende oder entzündungshemmende Wirkung besitzen, und sogar Anti-Aging-Eigenschaften werden ihnen nachgesagt. Daher sind sie nicht nur für die Pharmaindustrie interessant, sondern kommen auch in Kosmetika, in der In-vitro-Diagnostik und in Nahrungsergänzungsmitteln vor.

Unicube Trace Probengeber
Beladung des Unicube Trace Probengebers. (Bild: Elementar)

Auf den Nettopeptidgehalt kommt es an

Mittlerweile produzieren viele Peptidhersteller sogar kundenspezifische Peptide. Peptide werden als gefriergetrocknetes Pulver ausgeliefert, wobei 1 mg Pulver nur 60 bis 80 % Peptidmaterial enthält. Um das Peptidpulver in der richtigen Dosierung in ein Therapeutikum einzubringen, muss zuerst die Menge des Peptids im Pulver – der Nettopeptidgehalt – präzise bestimmt werden.

Weil Peptide oft in Chargen von wenigen Gramm hergestellt werden, muss die Bestimmung des Nettopeptidgehalts mit möglichst kleinen Mengen an Probenmaterial auskommen. Trotzdem darf die Genauigkeit und Präzision der Messung nicht leiden, da dies einen direkten Einfluss auf die korrekte Wirkstoffdosierung hat. GMP-Richtlinien sind ebenfalls bei der Nettopeptidbestimmung zu beachten.

Schlussendlich sollte die Analyse ein Minimum an manueller Arbeit und geringe Kosten pro Messung mit sich bringen, da sie Teil der Freigabe von jeder Peptidcharge ist.

Methoden zur Bestimmung

Für die Nettopeptidbestimmung stehen zwei Methoden zur Verfügung: Die Aminosäureanalyse und die CHN-Elementaranalyse. Die Aminosäureanalyse benötigt geringe Mengen an Probematerial, besitzt aber eine begrenzte Genauigkeit. Des Weiteren beinhaltet sie viele Prozessschritte und erfordert reichlich manuelle Zu-arbeit. Dies beinhaltet konkret zunächst die Hydrolyse der Peptide durch Kochen in konzentrierter Salzsäure, eine folgende Vorsäulenderivatisierung von freien Aminosäuren sowie schließlich die Trennung und Detektion der Aminosäuren mittels Hochleistungs-Chromatographie.

Im Vergleich zur Aminosäureanalyse liefert die Elementaranalyse deutlich präzisere Ergebnisse und besticht durch minimale Probenvorbereitung sowie weitgehende Automatisierung. Aufgrund von Fortschritten in der Detektorentechnologie ist nun auch die letzte Barriere überwunden – die Probenmenge. Mittlerweile genügen Probenmengen von weit unter 1 mg Peptidpulver.

Bei der Elementaranalyse wird der absolute Stickstoffgehalt des Peptidpulvers ermittelt. Aus diesem lässt sich der Nettopeptidgehalt leicht berechnen: Nettopeptidgehalt = absoluter Stickstoffgehalt des Pulvers ×100/(%N im Peptid).

Hierbei ist „%N im Peptid“ eine bekannte Größe, die sich aus der chemischen Formel des Peptids ableitet. Vom absoluten Stickstoffgehalt auf den absoluten Peptidgehalt im Pulver zu schließen ist möglich, weil das Peptidmaterial die einzige Stickstoffquelle im Pulver ist. Andere Bestandteile des Pulvers – Reste des Lösungsmittels, Wasser und Gegenion - enthalten keinen Stickstoff.

Fläschchen mit Peptiden
Peptide aus dem Portfolio von Bachem. (Bild: Elementar)

Für die Wirkstoffcharakterisierung traditioneller Pharmazeutika werden Stickstoff- sowie Kohlenstoff-, Wasserstoff- und Schwefelgehalte seit Jahrzehnten zuverlässig mittels CHNS-Elementaranalysatoren wie dem Unicube von Elementar bestimmt. Auch in der Welt der Peptide ist die Elementaranalyse mittlerweile zum Goldstandard für die Nettopeptidbestimmung geworden. Sowohl der Unicube als auch sein Bruder, der Unicube trace, der für Stickstoff noch 4x empfindlicher ist, kommen hier routinemäßig zum Einsatz. Zwar lagern viele Peptidhersteller die Analysen oft noch an Auftragslabore aus. Viele Hersteller beschaffen sich jedoch mittlerweile ein eigenes Gerät, sobald sie erleben, wie einfach und kostengünstig diese Analyse selbst zu betreiben und mittels integrierter Software zu dokumentieren ist.

Einfach und präzise zum absoluten Peptidgehalt

Die Stickstoffanalyse des Peptidpulvers lässt sich mit den Verbrennungselementaranalysatoren leicht durchführen. Abgesehen vom Wiegen und Verpacken des Peptidpulvers in Zinnfolie ist die Analyse vollautomatisch und dauert nur 5 bis 12 Minuten. Die genaue Analysendauer hängt davon ab, wie viele Elemente zusätzlich zum Stickstoff gemessen werden. So kann der Unicube noch den Gehalt von bis zu drei weiteren Elementen (C, H und S) im gleichen Analysenlauf messen.

Nachdem die Probe in den Probengeber eingeführt und der Analysenstart initiiert wurde, durchläuft sie automatisiert folgende Schritte: Zuerst wird die Umgebungsluft, die mit der Probe in den Analysator gelangt ist, mit Trägergas weggespült. Dann fällt die Probe in einen heißen Ofen, wo sie verbrannt und damit vollständig in Gas umgewandelt wird. Der Stickstoff der Probe ist nun als N2-Gas vorhanden. Nachdem die anderen Gase vom N2 getrennt wurden, wird Stickstoff mit einem Wärmeleitfähigkeitsdetektor nachgewiesen. Das Stickstoffsignal dieses Detektors wird als Peak in der Analysensoftware angezeigt. Das Analysegerät rechnet dann die Peakfläche in den absoluten Stickstoffgehalt um, basierend auf der mitgelieferten Langzeitkalibrierung.

Beide Analysatoren verfügen über fluorbeständiges Säulenmaterial, das auch TFA, dem Standard-Gegenion der Peptide, standhält. Die Kosten pro Analyse liegen im Durchschnitt bei 0,53 EUR. Die Analysatoren sind so konzipiert, dass die Wartung selten und schnell erfolgt und ohne Werkzeuge möglich ist.

Validierung der Genauigkeit

Um die Genauigkeit des Unicube trace zu überprüfen, wurden zwei Peptide aus dem Portfolio des Herstellers Bachem analysiert. Der mit dem Analysator ermittelte Stickstoffanteil im Peptidpulver kann mit dem zertifizierten Wert, der aus dem mitgelieferten analytischen Datenblatt hervorgeht, verglichen werden.

Das erste Peptid (C₂₃H₃₄N₆O₆, TFA-Salz, Produktnummer 4025806) ist ein Hemmstoff von menschlichen Matrix-Metalloproteasen und findet in der Krebsforschung Anwendung. Von diesem Peptidpulver wurden 0,4 mg in Zinnfolie eingewogen, verpackt, und auf dem Probenteller des Unicube trace platziert. Sobald die Stickstoffanalyse über die Software gestartet wird, verläuft diese vollautomatisch. Eine Fünffachbestimmung des Stickstoffanteils im Pulver mit dem Elementar-Analysator ergab 13,57 % mit einer absoluten Standardabweichung von 0,08 %. Dies stimmt sehr gut mit dem von Bachem zertifizierten Stickstoffanteil von 13,60 % im Pulver überein.

In einem zweiten Experiment wurde das GHK-Tripeptid (C₁₄H₂₄N₆O₄, Acetatsalz, Produktnummer 4000308), welches biologische Aktivitäten im Zusammenhang mit Alterung und Wundheilung aufweist, analysiert. Ziel dieses Experiments war die Präzision der Messungen relativ zur Stickstoffmenge der Probe zu demonstrieren. Hierzu wurde das Peptidpulver in Wasser gelöst und eine Teilmenge mit dem Unicube trace analysiert. Für Proben mit jeweils 10 µg N, 20 µg N und 60 µg N wurden Fünffachbestimmungen des Stickstoffanteils in der Lösung durchgeführt, aus denen der Stickstoffanteil im Peptidpulver berechnet wurde. Die Ergebnisse in Tabelle 2 zeigen, dass der Stickstoffanteil mit dem Unicube trace selbst für Proben mit sehr kleinen Mengen an Stickstoff noch genau und präzise bestimmt werden kann: 19,82 ± 0,03 % N bei 60 µg N und 19,83 ± 0,05 % N bei 20 µg N im Vergleich zu einem zertifizierten Wert von 19,76% N. Dies entspricht einer relativen Standardabweichung von 0,17 % bei 60 µg N und 0,26 % bei 20 µg N.

Tabellen
(Bild: Elementar)

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